CCK-8/MTT

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CCK-8/MTT

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仪器型号:

多功能微孔板检测分析系统,多功能酶标仪,生物方案定制,美国-DeNovix DS-11 FX+超微量分光光度计,美国-美国伯乐-Bio-RAD酶标仪(iMARK Microplate Reader)等

预约次数:

126次

服务周期:

平均5-10个工作日

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常见问题

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1.液体类

    根据测试时样本浓度和检测时间点而定,按照单次检测需要的3-5倍的量寄送;若采用稀释后样本测试,则须告知稀释倍数及工作液浓度;若溶剂为有机溶剂(如DMSO,醇类,酚类等),最高工作液浓度中,溶剂的占比低于0.5%。

2.粉末类

    根据测试时样本浓度和检测时间点而定,按照单次检测需要的3-5倍的量寄送;

    a. 可溶性粉末:注明溶剂的种类(如无水乙醇,异丙醇,DMSO,培养基,PBS或者生盐水等),当样品对溶剂有特殊需求时,请在送样时附加所需溶剂;

    b. 不可溶粉末:注明样本性质,灭菌方式,及分散为均匀悬浮液所需必要步骤,

     如果不可使用分散液,需要预试,样本量可跟前期对接技术顾问沟通确认。

3.块体类

    a. 样品与细胞的作用方式为直接接触的话,至少3个/种细胞/时间点;

    b.样本处理方式为浸提的话,可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提,根据浸提方式按量和检测时间点提供;

    c.若是需要把细胞接种到材料上的话,金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形,建议制备直径为5-7 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪,默认制备直径为6 mm。

    注:测试时,默认每组3个平行,每孔培养基加样量100μL

 



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项目介绍

   细胞毒性检测是生物相容性测试的一种,检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况,即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响,来评价药物或材料的毒性或者活性,主要用于药物活性筛选、细胞增殖/毒性测定、抗肿瘤药效计算IC50等;常用MTT法或者CCK8法检测,另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像,更直观的记录细胞的存活情况。

1.CCK-8测试

    实验原理:CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂)中含有WST–8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐),它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan),生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比,用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。注:贴壁细胞和悬浮细胞均可使用此方法,悬浮细胞CCK-8孵育时间应适当延长。

   服务流程:

                                 2.png

2.MTT测试

    实验原理:活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能;二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臢,MTT结晶形成的量与细胞数成正比,使用多功能酶标仪在490nm处测定其吸光值,从而定量测定细胞的存活比例。注:多用于贴壁细胞。

    服务流程:

                                  1.png

样品要求

1.液体类

    根据测试时样本浓度和检测时间点而定,按照单次检测需要的3-5倍的量寄送;若采用稀释后样本测试,则须告知稀释倍数及工作液浓度;若溶剂为有机溶剂(如DMSO,醇类,酚类等),最高工作液浓度中,溶剂的占比低于0.5%。

2.粉末类

     根据测试时样本浓度和检测时间点而定,按照单次检测需要的3-5倍的量寄送;

    a. 可溶性粉末:注明溶剂的种类(如无水乙醇,异丙醇,DMSO,培养基,PBS或者生盐水等),当样品对溶剂有特殊需求时,请在送样时附加所需溶剂;

    b. 不可溶粉末:注明样本性质,灭菌方式,及分散为均匀悬浮液所需必要步骤,

     如果不可使用分散液,需要预试,样本量可跟前期对接技术顾问沟通确认。

3.块体类

    a. 样品与细胞的作用方式为直接接触的话,至少3个/种细胞/时间点;

    b.样本处理方式为浸提的话,可参考国标ISO 10993-12 2007中的浸提方式浸提,根据浸提方式按量和检测时间点提供;

    c.若是需要把细胞接种到材料上的话,金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形,建议制备直径为5-7 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪,默认制备直径为6 mm。

    注:测试时,默认每组3个平行,每孔培养基加样量100μL



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计算公式:
  细胞存活率 = [(实验孔 — 空白孔)/ (对照孔 — 空白孔)] × 100%
  抑制率 = [(对照孔 — 实验孔) / (对照孔 — 空白孔)] × 100%
  实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8/MTT、待测物质)
  对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8/MTT,不含有待测物质)
  空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基,含有 CCK-8/MTT)

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常见问题
一个孔中应接种多少个细胞?

当使用标准 96 孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为 1000 个/孔 (100 ul  培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于 2500 个/孔 ( 100 ul培养基)。如果要使用 24 孔板或 6 孔板实验,请先    计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的 10% 加入 CCK-8 溶液。

每次测定的数值不一样,是什么原因?如何解决?

可能会有以下几个原因: 1. 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。 一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。 2. 有可能会因为 CCK-8 沾在壁上而产生误差,建议在加入 CCK-8 后,轻轻敲击培养板以帮助混匀。 3. 每孔的细胞数量过多或过少,可预先在 1000~100000 个/孔范围内摸索条件。

哪些物质会影响 CCK-8 的测定?

当有还原性物质存在时会影响 CCK-8 的测定,例如含有维生素 C 的 Glucose 等 (一般培养基中的量不多,酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下,会增加空白吸收,但不影响测定,扣除空白吸收即可。

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