透射电镜把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。透射电子显微镜的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～百万倍， 用于观察超微结构，即小于0.2µm、光学显微镜下无法看清的结构，又称“亚显微结构”，因此TEM是表征纳米颗粒尺寸和形态的重要方法，比较适合观察外泌体的形态。 

图1：透射电镜（SEM）

✎应用举例：

图2：小鼠肠上皮来源外泌体形态

 采用TEM很直观的观察到大量的双凹双层膜结构的囊泡样富集。 

 图3：2D和3D培养的人脂肪源干细胞

 从2D人脂肪源干细胞和3D人脂肪源干细胞（2D Exo和3D Exo）的培养基中分离出外泌体，用（TEM）观察到外泌体呈现脂质双层，杯状。 

NTA利用光散射和布朗运动的特性获得液体悬浮液中的样本粒度分布的检测方法。检测中通过光学显微镜，可直接观察纳米颗粒，收集纳米颗粒的散射光信号，跟踪其布朗运动轨迹，对复杂样品具有极高的分辨率。

图4：纳米颗粒示踪技术(NTA)

✎应用举例：

图5：A奶牛乳腺上皮细胞外泌体,B金黄色葡萄球菌处理（数量比MOI=10)后外泌体 

使用NTA技术确定外泌体大小，外泌体大小均一，A组平均粒径112nm ，粒径在40-180nm范围的颗粒数占总颗粒数的96.62%， B组平均粒径116nm，粒径在40-185nm范围的颗粒数占总颗粒数的97.73% 。 

 图6：2D和3D培养的人脂肪源干细胞

 NTA分析显示，2D和3D培养的人脂肪源干细胞平均粒径均为100nm左右。

 WB是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，它是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，然后分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

图7：蛋白质印迹法（Western Blot）

✎应用举例：

图8：A549衍生外泌体和A549总细胞裂解物的WB分析

WB分析显示，存在典型外泌体标记物如CD63、CD81，和肿瘤易感性TSG101,TSG101是一种特异性蛋白，CD63和CD81蛋白是四跨膜蛋白超家族tetraspanin成员。顺式高尔基基质蛋白130（GM130）和外线粒体膜20（TOMM20）仅存在于细胞裂解物中，表明了肺癌衍生外泌体的纯度。

图9：帕金森患者（PD）和正常人血清外泌体WB分析 

PLTP、SERPINA3和HPX在包括PD在内的中枢神经系统疾病中具有重要作用，WB分析了PLTP、SERPINA3和HPX在健康者和PD患者血清外泌体中的表达。 

流式细胞术（FCM）是对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术，用于对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选。 

图10:流式细胞术

图11：人脐带间充质干细胞细胞标志物表达

 流式细胞术检测显示高表达间充质干细胞标志物CD44、CD73、CD90、CD105，不表达血管内皮标志物CD31、白细胞标志物CD45。间充质干细胞标志物CD44、CD73、CD90、CD105表达率分别为95.2%、96.7%、94.3%、98.2%，而CD31的表达率为2.3%，CD45的表达率为3.2%。 

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