qPCR一e测试

预约须知

送样须知：

（1）A：细胞、细菌、真菌、动植物组织等均可寄送，为了保证实验要求，样品数尽可能准备充足。

样本形式	处理方式	保存	运输	可检测指标数
新鲜组织	1、 0.1g新鲜组织(至少) 2、加入1ml的Trizol（可选）	液氮或-80℃	干冰	3-5
细胞	1、培养基吸出弃掉，用PBS洗涤两次后，吸弃PBS。 2、每1*10^⁶个细胞加1ml TRIzol，细胞刮板挂或吹打使细胞脱落，吹至拉丝状，收集之后冻存备用。	液氮或-80℃	干冰	2-3
全血	1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。	4℃	冰袋	3-5
全血	2、4h内进行淋巴细胞分离	液氮或-80℃	干冰	询问
体液	1. 12000rpm/min离心10-20min，取沉淀	液氮或-80℃	干冰	询问

注意事项 1. 组织在1-2min内完成取材，速冻，，并立即放入-80℃或液氮中保存。

2. 有条件的话，最好先将样本在液氮中速冻，再转入-80℃冰箱中保存。

3. 使用的冻存管最好也用DEPC处理。

4. 对于组织及细胞样本，如果没有液氮或-80℃冰箱，也可用RNAlater保存，但是组织一定要切成比较小的块状，-20℃保存运输。

B：细菌沉淀：细菌量大于10^8的细菌/组，干冰邮寄

C：土壤、污泥样本：至少10g，干冰邮寄

D：环境水样：至少1L/组，寄送装有过滤定量水样的滤膜（4°C），干燥寄送。

如果其他样品寄送需求，请与工作人员沟通确认！

（2）待测样品为RNA样品及cDNA样本，RNA浓度不低于200ng/uL，DNA浓度不低于20ng/uL，核酸体积10uL/检测基因，且样品接收后需先进行质检，质检合格的开展后续项目（核酸样本需包装完整，离心管用封口膜封闭，干冰寄送）。

（3）不接受具有致病性的样品。

（4）待测样品（原始样品或者RNA或者cDNA，原始样品可由我们代处理，RNA样品及cDNA样本接收后需先进行质检，质检合格的开展后续项目）;

（5）提供所需的引物/标准品（或平台代设计及合成）；提供检测基因的序列和引物序列，若基因序列来自文献等其他途径，可以多参考几组，避免引物特异性不足，延长实验周期。

（6）其他所涉及的细胞、试剂盒以及生物耗材等平台都可以有偿提供。

交付内容：

实验报告（包括仪器设备厂家型号、试剂品牌货号、实验报告、引物信息、试剂仪器信息及扩增曲线、溶解曲线、数据分析结果等），原始数据。

试验周期

收到样品后1-2周，具体试验周期与工作人员沟通。

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项目介绍

1.简介

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。分为SYBRGreen法与TaqMan探针法。

荧光染料法：实验设计简单（仅需2个引物，无需设计探针），初始成本低，灵敏度高，但需要进行熔解曲线分析检验扩增反应的特异性。适用于非特异性检测（专一性要求不高或高通量检测）。

探针法：有高特异性（引物和探针共同于模板结合），高信噪比，能进行多重反应。但成本高，实验设计繁琐。适用于扩增序列专一检测。

2.服务流程

样品要求

（1）A：细胞、细菌、真菌、动植物组织等均可寄送，为了保证实验要求，样品数尽可能准备充足。

样本形式	处理方式	保存	运输	可检测指标数
新鲜组织	1、 0.1g新鲜组织(至少) 2、加入1ml的Trizol（可选）	液氮或-80℃	干冰	3-5
细胞	1、培养基吸出弃掉，用PBS洗涤两次后，吸弃PBS。 2、每1*10^⁶个细胞加1ml TRIzol，细胞刮板挂或吹打使细胞脱落，吹至拉丝状，收集之后冻存备用。	液氮或-80℃	干冰	2-3
全血	1、大于等于2ml全血加入EDTA或肝素抗凝。	4℃	冰袋	3-5
	2、4h内进行淋巴细胞分离	液氮或-80℃	干冰	询问
体液	1. 12000rpm/min离心10-20min，取沉淀	液氮或-80℃	干冰	询问

注意事项 1. 组织在1-2min内完成取材，速冻，，并立即放入-80℃或液氮中保存。

2. 有条件的话，最好先将样本在液氮中速冻，再转入-80℃冰箱中保存。

3. 使用的冻存管最好也用DEPC处理。

4. 对于组织及细胞样本，如果没有液氮或-80℃冰箱，也可用RNAlater保存，但是组织一定要切成比较小的块状，-20℃保存运输。

B：细胞沉淀：细胞量大于10^6的细胞/组；细菌沉淀：细菌量大于10^8的细菌/组；

C：土壤、污泥样本：至少10g；

D：环境水样：至少1L/组，寄送装有过滤定量水样的滤膜（4°C），干燥寄送。

如果其他样品寄送需求，请与工作人员沟通确认！

（2）待测样品为RNA样品及cDNA样本，RNA浓度不低于200ng/uL，DNA浓度不低于20ng/uL，核酸体积10uL/检测基因，且样品接收后需先进行质检，质检合格的开展后续项目（核酸样本需包装完整，离心管用封口膜封闭，干冰寄送）。

（3）不接受具有致病性的样品。

（4）待测样品（原始样品或者RNA或者cDNA，原始样品可由我们代处理，RNA样品及cDNA样本接收后需先进行质检，质检合格的开展后续项目）;

（5）提供所需的引物/标准品（或平台代设计及合成）；提供检测基因的序列和引物序列，若基因序列来自文献等其他途径，可以多参考几组，避免引物特异性不足，延长实验周期。

（6）其他所涉及的细胞、试剂盒以及生物耗材等平台都可以有偿提供。

结果展示

常见问题

熔解曲线出现双峰的原因？

引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。

镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。

模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

CT值偏大，大于35？

扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

绝对定量和相对定量的区别？

绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。绝对定量的标准样品一般是指含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒、含有和待测样品相同扩增片段的cDNA，PCR的产物，把它们分别稀释为不同的浓度作为模板进行反应。横坐标为标准品拷贝数的对数值，纵坐标为得到的CT值，可做出标准曲线，根据未知样本的CT值，可在标准曲线中得到样本的拷贝数进而对未知样本进行定量。

相对定量是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化，也就是比较经过处理的样本和未经处理的样本之间的相对基因表达差异，常用方法有标准曲线法和2 －△△CT法；其结果必须用内对照基因（管家基因）校正；管家基因通常指维持细胞基本代谢活动所必须的基因，如GAPDH/Actin/18s rRNA等，实际操作中可依据文献或具体实验进行筛选。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。