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TUNEL

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TUNEL

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细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上荧光素 (FITC) 标记的dUTP (fluorescein-dUTP) ,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

样品要求

贴壁细胞或细胞涂片,固定后低温寄送;

悬浮细胞或细胞悬液,收集收集细胞(不超过200万细胞),PBS或HBSS洗涤一次。 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟,低温寄送。

石蜡切片可常温寄送。

结果展示


TUNEL

常见问题
荧光信号弱或没有荧光信号

原因1:样本处理不当

        1)样本切片太厚。建议适当将切片切薄一点,便于染色。

        2)脱蜡和水化不充分。建议脱蜡先60 ºC 20 min,再使用二甲苯两次5-10 min;而水化用梯度乙醇从高到低浓度浸洗。

        3Proteinase K的孵育时间过短。优化Proteinase K的孵育时间,常用时间10-30 minμm左右的片子孵育10 min30μm左右的片子孵育30 min

        4Proteinase K浓度过低。建议蛋白酶K一般工作液浓度为20 μg/mL

        5)放置在-20 ºC保存较长时间的切片不新鲜,减低染色效率。建议使用新鲜切片。

原因2:染色操作不当

        1染色时间过短。建议一般 37 ºC 孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2 h,但要结合背景着色。

        2TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。建议适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。

        3TdT酶失活。建议TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导致TdT酶失活。

        4样本干燥。加上TUNEL反应液后,请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行,保证样本均匀染色,又可防止反应液干燥。



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