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蛋白含量测试
蛋白含量的测定是生物化学、分子生物学、临床医学以及食品科学等多个领域中不可或缺的基本实验步骤。准确测量蛋白质浓度对于保证下游实验如Western Blot、ELISA、免疫沉淀等实验结果的可靠性至关重要。测试方法1、Bradford法（考马斯亮蓝）：Bradford法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料在特定条件下形成稳定的复合物，其最大吸收峰会发生显著变化，通过分光光度计测定吸光值的变化即可计算出蛋白质浓度。（1）实验准备准备不同已知浓度的标准蛋白溶液以绘制标准曲线。配制Bradford试剂（市售即用型或按厂家说明配制）。（2）操作步骤取若干微孔板，每孔加入一定量待测蛋白样品及一系列标准蛋白溶液。向各孔加入等体积的Bradford试剂，混匀后室温静置一段时间（通常为5-10分钟）。使用分光光度计在595nm波长下测定各孔的吸光值。以标准蛋白浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2、BCA法：基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA鳌合Cu+作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。(1)实验准备a. 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20ºC长期保存。b. 取适量25mg/ml蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20µl 25mg/ml蛋白标准，加入980µl稀释液即可配制成 0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS 稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20ºC长期保存。（2）操作步骤a. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分 别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20µl，需加标准品稀释液补足到20µl。请注意记录样品体积。c. 各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放置20-30分钟。 注: 也可以室温放置2小时，或60ºC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反 应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。3、凯氏定氮法 它是通过测定样品中的总氮含量间接反映蛋白质总量的一种方法，因为蛋白质含氮量相对恒定（约16%）。当样本与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强践行条件下将氨整出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。总结来说，不同的蛋白含量测定方法各有优劣，选择合适的方法取决于实验需求、灵敏度要求以及可能存在的干扰因素。
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