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激光共聚焦显微镜常见问题(一)


荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别?
一、原理不同
1、荧光显微镜:是以紫外线为光源, 用以照射被检物体, 使之发出荧光, 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
2、激光共聚焦显微镜:在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针。
二、特点不同
1、荧光显微镜:用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光。
2、激光共聚焦显微镜:利用计算机进行图象处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
激光共聚焦显微镜原理?

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式,采用激光束作光源,激光束经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本焦平面上每一点进行扫描。

组织样品中如果有可被激发的荧光物质,受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,处理后在计算机显示器上显示图像。

在这个光路中,只有在焦平面的光才能穿过探测针孔,焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的,不能通过小孔。因此,非观察点的背景呈黑色,反差增加,成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔,焦平面以外的点不会在探测针孔处成像,即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,故称为激光扫描共聚焦显微镜。

共焦和共聚焦的区别?
所谓的共聚焦就是:从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上,如果物体恰在焦点上,那么反射光通过原透镜就会汇聚回到光源,这就是共聚焦,简称共焦。
与普通荧光显微镜相比激光共聚焦优势在哪?
与普通荧光显微镜相比激光共聚焦优势有:
1、多重染色
1)多重染色时,各染料之间的cross-talk较少。2)可使用Cy5染料 Cy5的激发波长是645nm, 荧光emission波长是670-680nm, 人眼的可见光 波长是390-750nm。
2、Z轴上的分解能高。
1)可了解组织的3D结构。2)可观查被染上荧光的物质在细胞里的分布:例如,是在细胞膜上还是在细胞核里。3)即使组织标本较厚,也可获得鲜明的画像。
3、高画质
 1)通过调节pin-hole,不但可提高Z轴上的分解能,也可提高X-Y轴上的分解能。2)可以在光学和电子两个水平调节对比度,因此可以从低对比度组织标本,拍摄到高对比度的图像。
激光共聚焦显微镜、扫描电镜原子力显微镜三者的区别?
三者都是点源逐点扫描成像,通过控制扫描驱动范围,调节放大倍数,主要区别
1、极限分辨率不同, 缘于放大信号源的差异
激光共聚焦:极限分辨率 150nm.
扫描电镜:20nm~0.8nm.
原子力显微镜:极限分辨率0.1nm
2、扫描驱动方式不同
激光共聚焦:激光转镜控制激光扫描范围和扫描速度。
扫描电镜:电磁线圈控制电子束扫描范围和扫描速度,
原子力显微镜:压电位移传感器驱动样品台X,Y 方向扫描,
3、立体成像的差别
激光共聚焦:通过纳米精度步进电机驱动样品在Z轴方向逐层成像,软件将设定的各层图像合成清晰立体图像。
扫描电镜:单帧图像具有很大景深,但属于二维图像,通过立体对技术可实现三维成像。
原子力显微镜:成像的本质就是测量表面每个像素点的高低,描绘出立体形貌。
4、工作环境差别
激光共聚焦和原子力显微镜可以在大气环境中进行测试样品
一般扫描电镜必须在高真空环境下进行测试样品
5、应用范围差别
激光共聚焦:几倍 ~ 几千倍,样品制备简单
扫描电镜 :几倍~几十万倍,样品制备稍微复杂一些,但总体也很简单。

原子力显微镜:几万倍~几千万倍, 要求样品非常平坦,样品制备很难。

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