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一文读懂蛋白质含量测定方法

2023-03-24 11:51:51 0 997

本文文叙述了蛋白质含量常用检测方法，主要包含各种检测方法的原理、优缺点等等，以便于根据不同需求选择合适的蛋白质检测方法。

紫外吸收法

检测原理：

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共扼双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，进行蛋白质含量的测定。

图1：紫外分光光度法标准曲线

方法特点：

优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。

缺点：测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多。

干扰物：含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质。

检出限：50~100ug蛋白含量。

适用范围：适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质

微量凯氏定氮法

凯氏定氮法被国内外视为蛋白质含量的标准检验方法，可作为衡量其他蛋白质含量检测方法准确性的标准。

实验原理：

样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。

图2：蒸馏装置

方法特点：

优点：通用性强，测定费用低，易实现，仪器简单且测定结果的重复性和重现性好。

缺点：实验耗时长、灵敏度低。

检出限：0.2~1mg蛋白含量。

适用范围：凯氏定氮法测的是总蛋白的量，一些非蛋白氮无法检测出。

双缩脲法

实验原理：

双缩尿（NH₃CONHCONH₃）是两个分子经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱溶液中，双缩尿与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩尿反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽链，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩尿反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与蛋白质分子量及氨基酸成分无关。

图3：双缩尿反应络合物

方法特点：

优点：适合检测总蛋白质的含量，操作简单、测量速度快。

缺点：标准物质必须使用代表性很强的样品，需使用其他参考方法测出标准物质中的蛋白质总含量，故测定工作费力费时。不宜测定样品种类多、彼此差异大的样品。

检出限：测定蛋白质含量测定范围为1-20mg蛋白质。

干扰物：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

适用范围：常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

Lowry法

Lowry 法是双缩脲法的发展，结合了双缩脲试剂和酚试剂与蛋白质的反应，是最灵敏的蛋白质测定方法之一，在生物化学领域得到广泛的应用，目前分为基本法和改良简易法，改良简易法可获得与基本法相近的结果。

基本法实验原理：

显色原理与双缩尿法相同，但加入了Folin-酚酞试剂，以增加显色量，从而提高检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：①在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。②Folin一酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

特点：

优点：灵敏度高。

缺点：耗费时间长，操作时间需精准控制，标准曲线绘制麻烦，专一性较差，干扰物质比较多。

检出限：可检测的最低蛋白质量达5ug。通常测定范围是20~250ug。

干扰物：酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等。

适用范围：除蛋白含量测定，也可用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。

考马斯亮蓝法

实验原理：

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（max），由465mm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595mm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

图4：考马斯亮蓝G-250

方法特点：

优点：灵敏度比Lowry高约4倍，高效率、检测过程简便、只需要一种试剂，抗干扰能力强。

缺点：测定误差大，不适用于不同蛋白的检测。

检出限：其最低蛋白质检测量可达1ug。

干扰物：干扰物质少，但去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、0.1N的NaOH会干扰实验测定。

适用范围：可应用于医疗保健及食品行业的蛋白质测定。

蛋白质含量检测方法选择

蛋白质含量测定时，考虑以下因素后选定适用的检测方法。

❆ 实验对测定所要求的灵敏度和精确度；

❆蛋白质的性质；

❆ 溶液中存在的干扰物质；

❆测定所要花费的时间。

参考文献

[1] 刘利娟.乳及乳制品中蛋白质含量测定方法研究进展[J].轻工标准与质量,2022(01):85-87. DOI: 10.19541 / j. cnki. issn1004-4108. 2022. 01.0 15.

[2] 张品,余顺波,朱文秀,陈大伦.紫苏饼粕分离蛋白中蛋白质含量测定方法比较[J].粮食与油脂,2021,34(11):150-154.

[3] 黄晓君,李俏,周建湘.猪脑蛋白质含量测定研究[J].现代食品,2019(13):156-157+ 169. DOI:10.16736/j. cnki. cn41-1434/ ts. 2019. 13. 049.

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蛋白含量测试

蛋白含量的测定是生物化学、分子生物学、临床医学以及食品科学等多个领域中不可或缺的基本实验步骤。准确测量蛋白质浓度对于保证下游实验如Western Blot、ELISA、免疫沉淀等实验结果的可靠性至关重要。测试方法1、Bradford法（考马斯亮蓝）：Bradford法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料在特定条件下形成稳定的复合物，其最大吸收峰会发生显著变化，通过分光光度计测定吸光值的变化即可计算出蛋白质浓度。（1）实验准备准备不同已知浓度的标准蛋白溶液以绘制标准曲线。配制Bradford试剂（市售即用型或按厂家说明配制）。（2）操作步骤取若干微孔板，每孔加入一定量待测蛋白样品及一系列标准蛋白溶液。向各孔加入等体积的Bradford试剂，混匀后室温静置一段时间（通常为5-10分钟）。使用分光光度计在595nm波长下测定各孔的吸光值。以标准蛋白浓度为横坐标，对应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。2、BCA法：基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA鳌合Cu+作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性。可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。(1)实验准备a. 取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，也可以-20ºC长期保存。b. 取适量25mg/ml蛋白标准液，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20µl 25mg/ml蛋白标准，加入980µl稀释液即可配制成 0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS 稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20ºC长期保存。（2）操作步骤a. 将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20µl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20µl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20µl，需加标准品稀释液补足到20µl。请注意记录样品体积。c. 各孔加入200µl BCA工作液，37ºC放置20-30分钟。注: 也可以室温放置2小时，或60ºC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。d. 用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长的吸光度。e. 根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。3、凯氏定氮法它是通过测定样品中的总氮含量间接反映蛋白质总量的一种方法，因为蛋白质含氮量相对恒定（约16%）。当样本与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强践行条件下将氨整出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。总结来说，不同的蛋白含量测定方法各有优劣，选择合适的方法取决于实验需求、灵敏度要求以及可能存在的干扰因素。

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