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一文读懂CCK-8/MTT

2023-05-12 15:32:43 1 513

CCK-8法

CCK-8法（Cell Counting Kit-8）是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度、无放射性的比色检测法。

原理

WST-8化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）。

在电子耦合试剂存在情况下，WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan），其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，对同样的细胞，颜色的深浅和活细胞数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

图1：WST-8 反应

图2：CKK-8原理

实验步骤

👉取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液，每孔100ul加入96孔细胞培养板中。贴壁细胞，需37℃预培养2-6小时等细胞贴壁后开展实验，悬浮细胞不需要预培养。

👉依据实验需求，培养孔中加入0-10ul待测样本继续培养适当时间。细胞毒性试验，加入毒性物质后的培养时间需考虑毒性物质性质及细胞敏感性，一般根据细胞周期来决定。

👉取10ul CCK-8溶液加入96孔细胞培养板，37℃继续孵育0.5-4小时。

👉测定吸光度。建议采用双波长进行测定，检测波长430-490nm，参比波长600-650nm，或者采用450nm单波长检测。

MTT法

MTT技术又称为MTT比色法，也是一种检测细胞存活和生长的方法。

原理

MTT：一种黄色粉色染料，化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用DMSO溶解沉积在细胞中的甲臜后在490nm波长处测定其吸光度值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

图3：MTT结构式

实验步骤

👉铺板，采用96孔板，每孔细胞密度控制在4000-5000个，体积100 μl。

👉5%CO₂，37℃孵育，正常4到6小时贴壁后即可,加入浓度梯度的药物。

👉5%CO₂，37℃孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。

👉每孔加 20 µl MTT 溶液（5 mg/ml）继续培养 4h。若药物与 MTT反应，可先离心后弃去培养液，小心用 PBS 冲 2-3 遍后，再加入含 MTT 的培养液。

👉终止培养。

👉每孔加150 µl 二甲基亚砜，震荡使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪 OD490nm 处测量各孔的吸光值。

CKK-8/MTT应用

两种方法均用于细胞增殖，细胞活性测定，药物对体外培养的细胞毒性的测定。

CKK-8/MTT法对比分析

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