《Nature Chemistry》：纳米纤维一e测试

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《Nature Chemistry》：纳米纤维

2023-09-08 09:22:18 0 121

一、研究背景

循环对称和超螺旋对称在自然界中都很常见，但同时具有循环对称和内部超螺旋对称且对称轴重合的系统却很少（图 1a-c）。这种几何形状的优点是，单个原聚体可以根据内部超螺旋对称性随时进行扩展，这样新添加的部分与其循环对称的对应物之间的相互作用与原始原聚体与其对应物之间的相互作用相同。在蛋白质系统中，卷曲的线圈和胶原三螺旋具有这种非常有用的特性，并已在天然生物系统和蛋白质工程中得到广泛利用。在蛋白质设计中，人们利用这种几何形状创造出螺旋发夹，与平行或反平行的伴侣配对形成异二聚体，这些“碱基配对”相互作用还可以进一步扩展，创建出笼和二维晶格等高阶维度设计。然而，这些结构的几何形状有其局限性：单体具有柔韧性，不易与蛋白质融合，组装体的扭转和半径值范围狭窄，而且由于空间约束，不能轻易沿延伸轴堆叠。形成这种结构所需的超螺旋对称性也存在于螺旋重复蛋白中，无论是天然的还是设计的螺旋重复蛋白，都是由一个串联重复的球状蛋白单元组成，从而形成一种刚性结构。与单螺旋相比，从头设计螺旋重复蛋白（DHRs）作为原聚体具有潜在的优势，因为它们是刚性的，易于蛋白质融合，可以采用多种几何形状，并且可以通过非共价相互作用以头对尾的方式堆叠，就像 DNA 双螺旋与单链悬伸一样。不过，虽然已经使用 DHRs 生成了均聚物低聚物，但低聚物的环状轴和单体的超螺旋轴并不重合，因此延伸单体并不能像盘绕线圈和双链核酸那样延伸均聚物低聚物的界面。他们着手以环状螺旋重复蛋白（CHRs）为基础，系统地生成具有共享环状对称轴和超螺旋对称轴的蛋白质纳米结构。

二、研究成果

在这里，美国华盛顿大学Neville P. Bethel，David Baker等描述了一种生成模块化刚性重复蛋白质低聚物的系统方法，这种低聚物具有重合的 C₂ 至 C₈ 和超螺旋对称轴，可通过重复传播轻松扩展。从这些构建块中，他们证明了通过引入亲水性表面贴片，迫使单体交错排列，可以系统地设计出各种无界纤维；通过改变单体中重复单元的数量和亲水性贴片的位置，可以精确地调整这种纤维的几何形状。相关研究工作以“Precisely patterned nanofibres made from extendable protein multiplexes”为题发表在国际顶级期刊《Nature Chemistry》上。祝贺！

三、图文速递

图1. CHR概念和设计方法

图2. 从C₃到C₈对称性的实验验证多路复用

他们在大肠杆菌中表达了 67 种由蛋白质MPNN设计的多聚体，并通过尺寸排阻色谱法（SEC）鉴定了它们的低聚状态。在这些设计中，有 60 种是可溶的，67 种中有 11 种是单分散的，其洗脱曲线与低聚状态一致。尺寸排阻色谱-多角度光散射（SEC-MALS）测量进一步证实了这 11 种设计和 Rosetta 设计的一种二聚体的低聚状态（图 2）。

图3. 四重和八重复用的高分辨率结构确定

他们通过 X 射线晶体学、低温电子显微镜（cryoEM）或两种方法测定了 C₂ 至 C₆ 对称性的五种设计的高分辨率结构（图 3）。

原则上，可扩展性是螺旋重复蛋白低聚体的主要优势，因为它们具有排列的超螺旋和环状对称轴。与 DNA 双链一样，它们也可以通过增加重复序列进行几何扩展，而且每增加一个重复，界面接触就会增加（图 1c）。为了研究这种可扩展性，他们设计了四种经过验证的四重复多路复用的八重复版本。这些蛋白质的主链是按参数扩展的，序列的设计与原始的四重复版本类似。通过 SEC-MALS 测定，经 SEC 纯化的蛋白质形成了单分散颗粒，其大小符合预期；通过阴性染色电子显微镜（nsEM）和冷冻电子显微镜（cryoEM）确认，其形状符合预期（图 3f-k）。

图4. 图案化纤维

相反，他们采用了“林肯日志”的方法，将有利于亚基-亚基紧密相互作用的非极性斑块与不利于埋藏的带电极性斑块交替排列。他们假设这将产生单体的偏移排列，在极性斑块区域产生具有空“孔”的纤维（图 4a）。他们从上述的 C₃ 到 C₆ 设计中生成了这种纤维设计。表面从疏水到亲水再到疏水的交替变化，减少了非特异性界面移动，提高了整体溶解度。

他们表达并表征了从四种经证实可延伸的 CHR 重新设计的 58 根纤维。在测试的纤维中，共有 25 根组装成 50 至 800 nm 的纤维，可通过 nsEM 观察到。这些纤维是可溶的，他们通过传统的固定金属亲和色谱法（IMAC）对其进行了纯化，并对洗脱馏分进行了筛选。纤维会随着时间的推移而增长：例如，C3HR3_9r_shift4（shiftN 指相邻单体之间 N 个重复序列的套准移位）在 37 °C下培养七天后从大约 50 nm 增长到 300 nm；纤维组装过程中显然存在动力学陷阱，只要有足够的时间或加热就能克服。他们从四种 CHR 中各选择了一根纤维，用 nsEM 对其进行进一步表征（图 4b）。纤维的直径与计算模型非常吻合，设计的表面图案与 nsEM 得出的二维类平均值密切匹配。他们通过冷冻电镜鉴定了其中两根纤维的三维结构（图 4c）。

图5. 雕刻图案纤维的结构和持久长度

四、结论与展望

他们设计的具有重合循环对称轴和超螺旋对称轴的组装体为蛋白质纳米材料的设计开辟了新的领域。这些设计跨越了广泛的单体配置，并可通过重复传播轻松扩展。通过将非极性单体-单体相互作用区域与带电/极性表面交替，这些表面对掩埋具有非常大的溶剂化自由能损失，可以稳健地产生具有不同孔隙率和几何形状的蛋白质丝。由此产生的多孔结构可提供类似胶原蛋白的生物矿化平台。孔还可以作为含有一个或两个重复单元的配体的结合位点，从而可以用与这些配体融合在一起的分子装饰纤维，其间距可随时调整。虽然他们在这里主要探讨的是一维蛋白质纤维的组装，但他们的方法应该可以扩展到二维和三维材料。例如，丝状物可以重铺形成三维晶格，或者有界环可以在二维中堆叠形成可延伸的薄片。

他们的研究表明，可以通过改变纤维的孔径来调节纤维的机械特性。孔径越小，纤维越硬，这种机制可用于调节由纤维制成的高阶材料的机械性能。机械性能的可调性可用于基于蛋白质的水凝胶，通过使用不同孔隙率的纤维可系统地改变体积模量，从而应用于组织工程和食品领域。这些设计具有稳健的热稳定性和高溶解率，因此可以使用标准程序进行大规模生产：使用低成本材料（盐、酵母提取物、糖等）在大肠杆菌中生产蛋白质，50 毫升培养物的产量为毫克，而使用标准生物反应器装置则可能达到克级产量。电荷和芳香度等特性可以通过表面残基的突变来确定，这可以用来设计与石墨烯或硅等材料的界面，从而产生生物电子。具有特定扭曲、低聚状态和半径的设计可生成与其他螺旋分子（如 DNA 和碳纳米管）的结合，从而为生物医学和材料挑战开辟了广泛的应用领域。

文献链接：

https://www.nature.com/articles/s41557-023-01314-x

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