研究背景

中空和管状结构赋予碳纳米管（CNTs）许多独特性质，广泛应用于分子传输、随机传感、具有内面体掺杂的晶体管和催化约束等。关于CNTs的分子传感，早期的工作集中在表面修饰和场效应晶体管的制造上。2010年，碳纳米管的管状结构开始被探索用于传感应用。

纳米孔传感依赖于监测分析物与纳米孔结合时通过纳米孔的离子电流波动。SWCNT纳米孔涉及不同的分子传感机理。SWCNT纳米孔内没有收缩或传感元件，但有理想的管状结构和原子光滑的表面。当分子在跨膜电位下或通过扩散穿过SWCNT纳米孔时，它可能通过非共价相互作用与CNTs内壁相互作用，由于碳纳米管内部环境的均匀性，无论相互作用发生在哪里，由分子-碳纳米管相互作用引起的电流变化都可能保持不变。这一特殊特征将提高SWCNT纳米孔中小分子的传感灵敏度。

研究成果

中国科学院赵宇亮研发团队用密度梯度超速离心（DGU）分离超短单壁碳纳米管（≈5–10 nm），并取适当的组分构建插入脂质双层的纳米孔传感器，SWCNT纳米孔在区分类似分子方面表现出非常高的分辨率，这种不同寻常的能力归因于SWCNT纳米孔中比本体溶液中更快的离子传输。SWCNT纳米孔中氨基酸等类似靶标的高分辨率识别有望应用于最近蓬勃发展的蛋白质测序技术中。 

此项研究工作以“High-resolution discrimination of homologous and isomeric proteinogenic amino acids in nanopore sensors with ultrashort single-walled carbon nanotubes”为题，发表在国际顶级期刊《Nature Communications》上。  

图文速递

一、单壁碳纳米管纳米孔的制备与表征

在浓硫酸/硝酸（3/1）中超声处理切割长SWCNT，随后DGU分离。DGU过程在分选SWCNT直径方面具有更好的分辨率（图1b），窄的电导范围意味着DGU分离后SWCNT的直径分布窄。图1b、c结果表明，这些SWCNT直径范围为1.1-1.5 nm，中心约为1.2 nm。

测量选定范围的SWCNT纳米孔的电流-电压（I-V）曲线。当两个腔室都充满相同浓度的电解质时，所有的I-V曲线都表现出线性特性。对于任何SWCNT纳米孔，当溶液pH从8.0调节到3.0时，电导率逐渐降低，可能是由于末端羧基的质子化。然后，通过反向电势测量进一步探索管的离子选择性，SWCNT纳米孔两侧暴露于不同浓度的电解质（顺式0.1M KCl/反式1.0M KCl），在pH=8.0时，K⁺/Cl⁻的选择性比（SR）为2.14，与生物α-溶血素（αHL）纳米孔及其突变体的选择性比大致相同，但远不如Noy及其同事报道的直径为0.8 nm的SWCNT的选择性比突出。当用HCl原位将溶液pH逐渐调节至3.0时，观察到K⁺/Cl^-的电导和SR都降低。测试较低组分的SWCNT，发现较大的电导管具有较小的K⁺/Cl-SR，当pH从8.0降低到3.0时，K⁺/Cl^-的SR也显著降低（图1e）。

图1：SWCNT纳米孔的设置和表征

二、dTTP通过SWCNT纳米孔的转运

使用2′-脱氧胸苷三磷酸（dTTP）测试这些直径≈1.2 nm的SWNCT纳米孔的传感能力，在相同的条件下分别通过耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）、αHL和SWCNT纳米孔进行dTTP易位实验，研究发现，dTTP通过MspA或αHL的易位每分钟只产生几个电流事件，而dTTP在SWCNT纳米孔中的捕获速率达到约150个事件 min^-1（图2a-c）。dTTP和SWCNT纳米孔之间的电压依赖性相互作用的结果证实了dTTP通过SWCNT易位。dTTP在三种类型的孔中的存在引起的电流堵塞显著不同（3.4%、9.0%、44.2%，图2d）。SWCNT纳米孔中的离子迁移率μ_K或μ_Cl是生物纳米孔中离子迁移率的数倍，其中离子迁移率与本体迁移率相同，短SWCNT内的离子迁移率增加了约50%。

图2：dTTP通过αHL、MspA和SWCNT纳米孔的转运

三、通过SWCNT纳米孔的Ca²⁺通量的光学成像

为进一步证实SWCNT纳米孔中离子传输，分别通过SWCNT纳米孔、αHL和MspA对Ca²⁺通量进行光学成像。此研究测量单个SWCNT内阳离子传输。离子选择性实验表明，SWCNT纳米孔具有适度的阳离子选择性，这意味着仍有相当数量的Cl^-流过管。使用液滴水凝胶双层（DHBs）的全内反射荧光（TIRF）显微镜，能够对通过不同类型纳米孔的Ca²⁺通量成像（图3a），首先用αHL纳米孔和分子适配器γ-环糊精（γCD）测试了成像系统，结果表明，αHL管腔内γCD可逆结合的荧光信号与相同过程的离子电流信号很好地匹配。接着采用该系统来监测通过SWCNT纳米孔的Ca²⁺通量，当SWCNT插入脂质层时，水凝胶中的Ca²⁺开始通过SWCNT向液滴迁移。易位后，Ca²⁺在SWCNT的顺式口遇到Fluo-4，然后可观察和记录Fluo4增强的荧光。此情况下，将dTTP与Fluo-4一起放入液滴中，观察到荧光信号的闪烁，是由于dTTP阻断了Ca²⁺离子通道，并进一步证实了SWCNT的插入（图3b）。这些荧光波动很好地对应于离子电流记录（图3c）。最后，在成像系统中用MspA和αHL取代SWCNT纳米孔，并记录通过这两个生物孔的Ca²⁺通量的光学信号。Fluo-4通过SWCNT、MspA和αHL的Ca²⁺增强荧光的统计结果见图3d。SWCNT传输的Ca²⁺引起的异常高的荧光强度只能由SWCNT内Ca²⁺的较高电泳迁移率来解释。 

图3：DHB设备中αHL、MspA和SWCNT纳米孔中Ca²⁺通量的光学成像 

四、SWCNT对氨基酸的鉴别

^{SWCNT内部较高的离子迁移率可导致随机传感过程中更显著的电流变化，基于此开发基于SWCNT的高分辨率纳米孔传感器。通过纳米孔进行蛋白质测序是一个新兴领域，但对于如何最终实现这一点还未达成共识。选择三对氨基酸，并用SWCNT纳米孔进行区分。第一对是天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），它们之间只有亚甲基的差异，Asp和Glu可以通过SWCNT纳米孔（图4a），苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）在SWCNT纳米孔中也可以区分由一个羟基引起的差异（图4b），亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）这对链异构体从未报道被任何纳米孔传感器所区分，尽管它们具有相同的分子式，仅在骨架结构上有所不同，但它们通过SWCNT纳米孔的易位谱，例如电流阻断和捕获率，却明显不同（图4c）。这对异构体引起的电流阻断的巨大差异很容易将它们区分开来。但此研究还不能在一个SWCNT纳米孔中进行所有的氨基酸鉴别。SWCNT的异质性被认为是传感应用中的一个缺点，但也为基于不同的SWCNT纳米孔并行构建传感阵列提供了机会，以捕获和区分20个氨基酸，这些氨基酸可以作为肽测序系统的关键组成部分。}

图4：利用SWCNT纳米孔识别三对氨基酸

结论与展望

通过密度梯度超速离心（DGU）分离超短单壁碳纳米管（≈5–10 nm），并取适当的组分构建插入脂质双层的纳米孔传感器，这些SWCNT纳米孔在相对窄的范围内表现出电导值，并且在感测小分子（例如dTTP）方面具有高灵敏度。dTTP通过SWCNT纳米孔易位过程中的电导率变化比MspA和αHL等生物纳米孔中的电导率高3-5倍。这种不寻常的现象归因于SWCNT纳米孔中比本体溶液中更快的离子传输。将SWCNT纳米孔应用于蛋白质氨基酸的鉴别，结果表明，对于最具挑战性的三对氨基酸Asp和Glu、Phe和Tyr、Leu和Ile，SWCNT纳米孔可以以足够高的分辨率来区分每一对，此研究朝着期待已久的先进蛋白质测序技术迈出的一小步，但意义重大。

文献链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38399-4