等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry, 简称ITC)是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。

ITC仪器包含参比池和样品池，其中参比池中加入稀释溶液作为对照，彼此通过绝热装置隔开。在恒温条件下，注射器中的药物溶液滴定到含有目的蛋白的样品池中，两种物质相互作用，释放或吸收的热量与结合量成正比，ITC工作原理如下图所示。当样品池中的蛋白溶液被药物分子饱和时，热量信号逐渐减弱，最后只能观察到滴定的背景溶液热量。

简单地说，就是指将一种反应物配制成澄清溶液放在一个温控样品池中，通过一个热电偶回路与参比池偶联，另一种反应物作为配体置于注射器中。其中，样品池和参比池通过绝热装置隔开，但保持环境条件相同。在恒定温度下，注射器以一定速度向样品池中不断滴加配体，注射器还具有搅拌功能，反应一定时间，仪器测量样品池的热量变化并使其与参比池平衡，显示为一个吸热或放热的峰。放热反应触发恒温功率的负反馈，而吸热反应则触发恒温功率的正反馈来保持温度恒定。

1、能够在单个实验中确定多个热力学结合参数（即化学计量、缔合常数和结合焓）；

2、对被研究体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件，即具有非特异性的独特优势；

3、样品用量小，灵敏度高且精确度高；

4、可测的亲和力范围从10^-2 M～10^-12 M；

5、实验时间较短，且操作简单（高自动化）；

6、无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰；

7、测量时不需要制成透明溶液；

8、不破坏样品结构，量热实验完毕，还可以进行后续生化分析。

TC是基于复合物形成时所放出或吸收的热量的精确测定，它是在一个实验中能够同时测量所有结合参数的先进技术。ITC样品池中蛋白分子的工作浓度范围是10~100 M，加样针内药物分子的工作浓度范围0.5~1 mM，两者相互作用的滴定曲线由ITC分析软件NanoAnalyze来处理，可以拟合得到相应曲线。获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括解离常数(Kd)、结合常数(Ka)、结合位点数(n)、摩尔结合焓（ΔH)、摩尔结合熵（ΔS)、吉布斯自由能(ΔG)、摩尔恒压热容(ΔCp)和动力学参数（如酶活力、酶促反应米氏常数（Km）和酶转换数）。

1、蛋白质-蛋白质相互作用(包括抗原-抗体相互作用和分子伴侣-底物相互作用)；2、蛋白质折叠/去折叠；

3、蛋白质-小分子相互作用以及酶-抑制剂相互作用；

4、酶促反应动力学；

5、药物-DNA/RNA相互作用；

6、RNA折叠；

7、蛋白质-核酸相互作用；

8、核酸-小分子相互作用；

9、核酸-核酸相互作用；

10、生物分子-细胞相互作用。

1、研究目的蛋白与抗癌药物的结合作用

根据抗癌药物与蛋白DPF2C2H2的滴定曲线，可以观察出顺铂与蛋白能发生相互作用。然后采用分析软件NanoAnalyze对ITC实验数据进行分析并拟合曲线，通过浓度梯度探索，最终实验结果显示：当顺铂、蛋白的工作浓度各为1 mM、0.025 M时，即二者浓度比为40倍时，得到的S曲线最好，相互结合作用最佳，滴定曲线如下图所示。

2、探究抗癌药物与DNA的相互作用

盐酸阿霉素（DOX）与DNA作用的ITC曲线如图，采用NanoAnalyze软件分析得到的热力学参数列于表中。对于第一类结合，ΔH1＜０，ΔS1＞０是一个稍有放热而熵增明显的过程，且结合平衡常数较大，这两种情况都会引起过程放热，所以第一类结合表现为焓－熵协同驱动过程，驱动作用力主要为静电作用。对于第二类结合，ΔH2＞０，ΔS2＞０是吸热且熵增明显的过程，结合平衡常数较小，这可能是因为DOX的疏水平面部分较深地嵌插至ＤＮＡ分子的疏水部分，并且DOX进入之后又会使原来处于较深层疏水空腔的全部或部分溶剂水分子进入溶液本体，转变为自由水分子，使混乱度增加，故表现为疏水作用为主的熵驱动过程。一定的温度和压力下，两类结合的ΔG值均为负值，说明两类结合过程均可以自发地进行，且生成的产物分子结构比较稳定。

3、探索蛋白质与小分子的相互作用

研究了四种钙盐滴定酪蛋白磷酸肽CPP后的热力学变化，如下图所示。不同的钙盐滴定 CPP 后的焓变，熵变及自由能均无显著性差异（p>0.05）。此外，不同钙盐与 CPP 结合的焓变均大于 0，为吸热反应，这与之前的研究一致。

此外，吉布斯自由能 ΔG (kcal/mol)均小于 0，表示模拟小肠末端环境下，CPP与四种钙盐均自发进行反应。并且，由于-TΔS 均大于ΔH，导致ΔG 小于 0，表明熵变克服了焓变，因此该反应是由熵驱动的，离子相互作用力是该过程的主要推动力。

[1]张慧. 等温滴定量热法和荧光淬灭法测定DPF2与抗癌药物的结合作用[D].华中师范大学,2016.

[2]王欢,苟杏杏,蒲小华,王姣,胡小兵,李宗孝.光谱及等温滴定量热法探究盐酸阿霉素与DNA作用机理[J].光谱学与光谱分析,2018,38(02):540-545.

[3]罗敏娜,肖杰,张惜君,李伟,曹素芳,彭小雨,曹庸.等温滴定量热法探索酪蛋白磷酸肽单体与不同钙盐的相互作用[J].现代食品科技,2020,36(10):86-92.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2020.10.0150.

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