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三维荧光光谱(EMMs)的原理及应用

2023-02-10 15:39:25 0 1398

荧光光谱法被用于物质的定性和定量检测分析，三维荧光光谱（Excitation-Emission-Matrix Spectra, 简称EEMs），是描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，通过一次扫描便有可能监测样本中全部组分，适用于对复杂混合物进行光谱表征，是一种具有广泛应用价值的光谱指纹技术。

其表现形式有2种：一种是以发射光波长为x轴，激发光波长为y轴，荧光强度为z轴的三维荧光立体图（三维投影图）。一种是以发射光波长为x轴，激发光波长为y轴的荧光强度等高线图（等高线荧光光谱图）。

图1 三维荧光立体图

图2 等高线荧光光谱图

EEMs测试原理

荧光光谱法检测原理见下图3，其中S₀（基态）、S₁（第一激发单线态）、S₂（第二激发单线态）分别表示电子的不同能量状态。当物质中的荧光分子受到入射光照射时，因为吸收到光能，处于基态S₀的电子会跃迁至S₁或者S₂；处于激发态的电子是不稳定的，会通过内部转换的方式回到S₁，最后恢复到基态S₀。当电子从激发态恢复到基态时，能量会以光的形式释放出来，从而发出荧光。

图3 荧光光谱检测原理

荧光光谱包含激光光谱和发射光谱。激发光谱：特定发射波长下，获取不同激发波长的荧光强度；发射光谱：特定激发波长下，获取不同发射波长的荧光强度。

三维荧光光谱也称为激发－发射矩阵光谱，可快速同步扫描激发波长和发射波长，获取样品的荧光强度。区别于激发/发射光谱等二维荧光光谱，三维荧光光谱能同时扫描并改变激发和发射波长，同步记录的荧光强度变化关系为二元函数，能更为全面、准确地表征待测物质的荧光特性。

EEMs优势

相比于单一激发光谱或者发射光谱，三维荧光光谱包含的信息全面而丰富，可完整描述荧光物质的特征信息，比如：荧光峰位置、荧光强度、荧光积分体积等，它适用于复杂有机物定性及定量分析。三维荧光光谱技术灵敏度高、选择性强、荧光信息丰富。

EEM应用

可广泛应用于环境安全（水体与土壤污染控制），工业过程（液体和不透明样品的过程控制，废水循环控制），食品加工（乳制品，食用油，饮料等）健康安全（细菌污染控制，食品保鲜控制），药物学（药物生产控制，药物配置研究等）生物技术（生物产品生产控制），农业（土壤健康与能力控制）医学（组织健康诊断）等领域。

EEM应用案例

1.微生物三维荧光光谱

以青贮丁梭菌、乳酸菌和乙酸菌在 0 和 24 h 的菌悬液的原始三维荧光图谱为例（图3）。细菌在不同时间点组分变化存在显著差异。微生物 0 和 24 h 在 200～300 nm间有 2 个特征荧光峰。第一个在 200～250 nm（峰值在 225 nm 附近）；第二个峰在 250～300 nm（峰值在 275 nm 附近），此二峰的产生主要与微生物体内固有的类蛋白质有关，分别对应酪氨酸和色氨酸类物质。荧光光谱颜色的鲜艳程度与荧光强度成正向相关。

微生物培养 24 h 后，2 个特征荧光峰的荧光强度显著增强，最强荧光峰位置稍向长波方向移动，峰宽变大，此现象主要是微生物生长过程菌体大量繁殖，体内固有物质增多。结果表明三维荧光光谱技术可以定性反馈不同时期微生物生长量，与平板计数法和比浊法测定结果呈现一致。

图4 乙酸菌、丁梭菌和乳酸菌 0 和 24 h 三维荧光光谱图

2. 某污水厂溶解性有机物（DOM）组分荧光特征与来源解析

平行因子法能够对 DOM 的三维荧光谱图进行解谱，充分利用荧光数据，鉴别单一荧光组分，故采用三维荧光光谱进行平行因子分析 (PARAFAC)，污水厂水样的荧光光谱特征进行解析，通过分析，得到 1 种类蛋白荧光组分和 1 种类腐殖酸荧光组分：C1(Ex/Em=245 nm/340 nm) 为色氨酸荧光峰，C2(Ex/Em=260 nm/410 nm) 为富里酸荧光峰，整明此污水厂含有类蛋白质组分和类腐殖质组分。

图4某污水厂水样荧光光谱图

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