生物膜干涉技术bli的应用步骤一e测试

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生物膜干涉技术bli的应用步骤

2025-03-06 14:14:42 0 84

　　生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry, BLI)是一种基于光学干涉原理的无标记技术，用于实时监测分子间的相互作用。BLI广泛应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子、抗体-抗原等生物分子间的结合动力学和亲和力研究。以下是关于BLI技术的详细介绍及其应用步骤。

　　基本原理

　　BLI利用光纤传感器表面形成的生物膜层与参考层之间的光程差变化来检测分子结合事件。当分子结合到传感器表面时，生物膜层厚度增加，导致干涉图样的位移。通过测量这种位移的变化，可以实时监测结合过程，并计算出结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)以及平衡解离常数(KD)。

　　主要设备

　　目前市场上常用的BLI设备是FortéBio系列仪器(如Octet系统)，它们提供多种类型的传感器头，适用于不同的实验需求。

　　实验步骤

　　1. 准备工作

　　选择合适的传感器：根据实验需要选择适当的传感器类型(如胺基化学修饰的传感器、链霉亲和素传感器等)。

　　缓冲液准备：准备适合样品的缓冲液(如PBS、HBS-EP+)，确保其兼容性和稳定性。

　　样品准备：制备高纯度的目标分子(如蛋白质、抗体等)，并稀释至适当浓度。

　　2. 传感器活化与固定

　　清洗传感器：将传感器放入洗涤缓冲液中进行预处理，去除杂质。

　　活化：对于胺基化学修饰的传感器，通常使用EDC/NHS活化剂激活羧基基团，使其能够与氨基反应形成共价键。

　　固定目标分子：将传感器浸入含有目标分子的溶液中，使目标分子共价结合到传感器表面。

　　封闭未结合位点：为了减少非特异性结合，通常使用乙醇胺或其他封闭试剂处理传感器表面。

　　3. 结合实验

　　基线稳定：将传感器浸入运行缓冲液中，等待信号稳定。

　　加载配体：将传感器浸入含有待测分子的溶液中，开始实时监测结合过程。

　　解离阶段：将传感器重新浸入运行缓冲液中，观察解离过程。

　　再生(可选)：如果需要重复使用传感器，可以通过特定的再生溶液(如低pH或高盐溶液)去除结合的分子，恢复传感器活性。

　　4. 数据分析

　　数据处理：使用仪器配套软件自动记录和处理数据，生成结合曲线。

　　拟合模型：选择适当的数学模型(如1:1结合模型、双位点结合模型等)对结合曲线进行拟合，计算结合和解离速率常数。

　　结果解读：根据拟合结果确定结合亲和力(KD = koff / kon)和其他动力学参数。

　　应用实例

　　抗体筛选与表征

　　使用BLI快速筛选高亲和力抗体，评估其与抗原的结合特性。

　　药物发现与开发

　　研究小分子药物与靶标蛋白的结合动力学，优化药物设计。

　　疫苗研发

　　分析疫苗成分与免疫细胞受体的相互作用，评估疫苗的有效性。

　　蛋白质相互作用网络

　　研究蛋白质复合物的组装机制，揭示细胞内信号传导途径。

　　注意事项

　　缓冲液选择：确保缓冲液不含干扰物质(如去垢剂、还原剂)，以避免影响传感器性能。

　　样品纯度：高纯度的样品有助于获得准确的动力学参数，建议使用HPLC或FPLC纯化样品。

　　温度控制：保持实验环境温度恒定，防止温度波动引起的信号漂移。

　　数据质量：定期校准仪器，确保数据的可靠性和重现性。

　　总结

　　BLI技术作为一种高效、灵敏的无标记检测方法，在生物分子相互作用研究中具有广泛应用前景。通过合理设计实验方案和严格的操作流程，可以获得高质量的数据，为后续的研究提供有力支持。