PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称，是一种体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。经过演化和革新，PCR技术已经发展了三代:普通PCR技术、实时荧光定量PCR技术(qPCR)以及数字PCR(dPCR)技术。

　　PCR的原理

　　PCR的基本原理与DNA的体内复制相类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性、退火和延伸三个基本反应步骤构成。

　　怎样区分PCR、qPCR、dPCR、RT-PCR、RT-qPCR:

　　1.普通PCR

　　普通PCR即一代PCR，使用普通PCR扩增仪扩增靶基因并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。

　　2.实时荧光定量PCR(Ouantitative Real-time PCRqPCR)

　　实时荧光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团，在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化，z后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。

　　qPCR常用的有两种方法：

　　①荧光染料法(SYBR Green l)

　　②荧光探针法(TaqMan)

　　3.数字PCR(Digital PCR，Dig-PCR，dPCR)

　　数字PCR即三代PCR，是对原始PCR的另一种改进，是一种能够实现核酸绝 对定量的精准检测技术。基于泊松分布原理将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元(纳升级)中，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有目标DNA分子，然后加入荧光信号进行扩增，从而实现靶标核酸分子的绝 对计数，提高检测灵敏度和准确度。

　　基于分液方式的不同，数字 PCR 主要分为3种：

　　①微流体数字PCR(Microfluidic digital PCR，mdPCR)

　　②微滴数字PCRDroplet digital PCR，ddPCR)

　　③芯片数字PCR(Chip digital PCR，cdPCR)

　　4.逆转录PCR(Reverse T ranscription-PCR，RT-PCR)

　　逆转录PCR也叫反转录PCR，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增相结合，也是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

　　RT-PCR技术灵敏且应用广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行，一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行;而在两步法中两个反应是分开依次进行的。

　　5.实时荧光定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR，RT-qPCR)

　　Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合，其中的”RT“是Reverse transcription(逆转录)的意思，所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR，即以mRNA或总RNA为模板，先反转录得到cDNA，再以cDNA为模板，通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性，但不能进行定量分析。

　　与RT-PCR一样，RT-qPCR定量分析RNA也有一步法和两步法两种方法。

　　不同PCR方法的主要优缺点

　　1. PCR

　　优点：成本低;标准完善;产物可回收用于实验。

　　缺点：操作繁琐;特异性和敏感性低;容易污染其他实验，只能定性不能定量。

　　2. qPCR

　　优点：特异性和灵敏度高;操作简便;可定量分析。

　　缺点：成本高;产物不可回收。

　　3. dPCR

　　优点：绝 对定量;更高的敏感性和特异性。

　　缺点：成本昂贵;操作复杂;费时

　　4. RT-PCR和RT-qPCR

　　优点：可与所有的 RNA 类型一起使用。

　　缺点：RNA 容易降解;RT步骤可能会增加时间和污染的可能性。

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